Projetos de pesquisa finalizados

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Projeto de pesquisa


  • Expressão de RNAm e atividade enzimática de transportadores iônicos nas brânquias de caranguejos do gênero Uca, os chama-marés

     
  • Coordenador do projeto: John Campbell McNamara  
  • Autor ou executor principal do projeto: Rogério Oliveira Faleiros  
  • Número do projeto: 789  
  • Categoria: Pós-doutorado 
  • Data de início das atividades no CEBIMar: 01/06/2012  
  • Data de término das atividades no CEBIMar: 30/11/2015  
  • Resumo: Os crustáceos constituem um táxon extremamente diverso e amplamente distribuído. A sobrevivência e o sucesso desse grupo resulta em parte da seleção diferencial de mecanismos fisiológicos que proporcionam a manutenção de um meio interno osmotica- e iônicamente estável, meio este que protege as células e tecidos contra as oscilações do meio externo, e que aparentemente permitiu a conquista de ambientes dos mais variados, desde os aquáticos de águas doce e salgada até o terrestre, passando por águas costeiras e estuários, ambientes de salinidade variável. Dentre as adaptações fisiológicas que permitiram a conquista desses ambientes osmoticamente hostis, incluem-se a redução da permeabilidade corporal, e a absorção e secreção eficiente de sal pelo epitélio branquial onde atuam transportadores iônicos como a Na+/K+- e V-ATPase e o simportador Na+/K+/2Cl-. Avaliar-se-á aqui processos bioquímicos e moleculares relacionados à fisiologia osmorregulatória em caranguejos chama-maré do gênero Uca, amplamente distribuídos em habitats osmoticamente diversos na costa brasileira (Baía de Guaratuba, litoral do Paraná; Praia de Itamambuca, litoral de São Paulo). Comparar-se-á tanto a expressão das subunidades α e B da Na+/K+- e V-ATPase branquial, respectivamente, quantificando o RNAm por RT-PCR em tempo real quanto suas correspondentes atividades enzimáticas específicas. Além disso, será investigada também por análise de expressão de RNAm por RT-PCR em tempo real, a participação do simportador Na+/K+/2Cl- nesses processos. Os achados contribuir 
  • Metodologia: 4.1 - Coleta e manutenção dos caranguejos em laboratório
    Com autorização prévia do IBAMA (licença 29594-1), aproximadamente 50 espécimes de cada espécie de caranguejo chama-maré do gênero Uca serão coletados na Baía de Guaratuba/PR (área de aproximadamente 40 km2, entre as coordenadas 48˚30’W, 25˚50’S e 48˚45’W, 25˚54’S), de acordo com Masunari (2006). Uca vitoriana será coletada em Itamambuca/ Ubatuba/SP (45°00'43.76"W, 23°24'27.30"S). Os espécimes serão coligidos manualmente das galerias ou diretamente da superfície do substrato. Os caranguejos serão transportados em pequenas caixas com esponjas umedecidas com água do local de coleta ao Centro de Biologia Marinha da Universidade de São Paulo (CEBIMar/USP) em São Sebastião/SP ou ao Laboratório de Fisiologia de Crustáceos (LFC) do Depto de Biologia da Faculdade de Filosofia, Ciências e Letras de Ribeirão Preto, onde permanecerão por três dias a 25 °C para o início dos experimentos de aclimatação.
    4.2. - Aclimatação dos caranguejos e medidas da osmolalidade e de concentração de Cl- da hemolinfa
    Grupos experimentais de 5–10 animais serão aclimatados em pequenas caixa
     
  • Etapas e cronograma:  
    Janeiro – Junho/2012
    Ø  Atualização bibliografia;
    Ø  Visita ao museu de Zoologia da USP (MZUSP) - reconhecimento das espécies do gênero Uca que serão estudadas;
    Ø  Coleta de espécies de Uca na Baía de Guaratuba/PR (exceto U. vitoriana);
    Ø  Coleta de U. vitoriana, Itamambuca/ Ubatuba/SP;
    Ø  Dissecção das brânquias das espécies de Uca para extração de RNA total e padronização dos ensaios bioquímicos.
    Julho – Dezembro/2012
          Ø  Atualização bibliografia;
     
    Ø  Clonagem, sequenciamento e análise junto ao banco de dados;
    Ø  Confecção dos primers específicos para os transportadores Na+/K+-, VATPase, Na+/K+/2Cl- e controle endôgeno PRL10 para as dez espécies de Uca;
    Ø  Padronização condições reacional para análise de atividade enzimática;
    Ø  Organização dos resultados;
    Ø  Entrega do relatório científico #1. 
    Janeiro – Junho/2013 
    Ø  Atualização bibliografia;
    Ø  Coleta de espéc
     
  • Palavras-chave: Osmorregulação, V-ATPase, Na+/K+-ATPase, expressão de RNAm, caranguejo chama-mares (Uca), simportador Na+/K+/2Cl-  
  • Condições ambientais: Maré baixa ;   
  • Área necessária no laboratório: sala de tanques para manutenção e exposição dos caranguejos, um espaço para dissecção dos mesmos. 
  • Equipamentos de laboratório: Lupa, Freezer -20 graus célsius e centrifuga refrigerada 
  • Será necessário: Montagem de alguma estrutura (estantes, aquários etc) ;  Auxílio técnico para manutenção de estruturas ou material biológico na ausência dos participantes do projeto ;  Auxílio técnico para coleta de organismos ou observações de campo ;  Coleta antecipada de organismos ;  Utilização de embarcação do CEBIMar ;   

  • Outros serviços de laboratório: Eventual utilização, se possível, do laboratório de biologia molecular (especificamente uso de um termociclador) 
  • Organismos a serem coletados: Coleta de Uca vitoriana e possivelmente de outras 9 espécies de caranguejo chama-maré (U. burgersi, U. cumulanta, U. leptodactyla, U. maracoani, U. mordax, U. rapax, U. thayeri, U. uruguayensis e U. v 
  • Locais para coleta: Uca vitoriana - Itamabuca/Ubatuba/SP; As outras espécies serão coletadas, se necessário, na região de Bertioga/SP 
  • Tipos de resíduos químicos e/ou infectantes a serem gerados durante o projeto:  
  • Quantidade de cada tipo de resíduo:
  • Periodicidade aproximada da geração dos resíduo:
  • Instituição(ções) de origem do projeto:

    • USP. Faculdade de Filosofia Ciências e Letras de Ribeirão Preto   
     
  • Participante(s) do projeto:

    • Nome: Mariana Vellosa Capparelli  
    • Função no projeto: Doutorando 
    • Início das atividades no projeto: 01/06/2012  
    • Fim das atividades no projeto: 30/06/2015  
    • Nome: Samuel Coelho de Faria  
    • Função no projeto: Doutorando 
    • Início das atividades no projeto: 01/06/2012  
    • Fim das atividades no projeto: 30/06/2015  
     
  • Recurso(s) destinado(s) ao projeto:

    • Situação: Concedido 
    • Agência de fomento: Fapesp 
    • Tipo de recurso: Bolsa 
    • Especificar o tipo de recurso: Bolsa de Pós-Doutorado 
    • Situação: Concedido 
    • Agência de fomento: Fapesp 
    • Tipo de recurso: Auxílio á pesquisa 
    • Especificar o tipo de recurso: auxílio (regular)individual à pesquisa 
    • Recursos em nome de: John Campbell McNamara 
     

    Etapas desenvolvidas e resultados obtidos:

  • O relatório apresenta dados oriundos de estudos moleculares que subsidiarão a avaliação da da expressão gênica de transportadores iônicos (Na+/K+-ATPase, V-ATPase e Na+/K+/2Cl-) em caranguejos chama-marés, gênero Uca. Os caranguejos foram coletados em São Sebastião, litoral norte de São Paulo e na Baía de Guaratuba/PR. Além disso, serão apresentadas sequências de genes relacionados a homeostase térmica e metabólica (HSP70 e LDH), obtidas como parte da contribuição e colaboração ao auxílio individual à pesquisa (Processo 2011/22537-0) do Prof. Dr. John Campbell McNamara, de cuja equipe faço parte.
    Os estudos moleculares resultaram em considerável avanço no conhecimento metodológico e divulgação de sequências de genes subjacentes a processos fisiológicos de osmorregulação e regulação térmica, bem como possibilitaram algumas análises que refletem, mesmo que superficialmente, a genealogia já documentada para as espécies avaliadas. Sequenciamos e depositamos as sequências parciais de cDNA para os genes codificadores para (i) a subunidade α da Na+/K+-ATPase, (ii) a subunidade B da V-ATPase, (iii) o simportador Na+/K+/2Cl-, (iv) a HSP70 e (v) a proteína ribossomal L10 (PRL10), gene normalizador, referência de expressão constitutiva, obtidas a partir do tecido branquial das espécies de caranguejos chama-marés, Uca burgersi, U. cumulanta, U. leptodactyla, U. maracoani, U. mordax, U. rapax, U. thayeri, U. uruguayensis e U. victoriana. Paralelamente foram obtidas sequências parciais de cDNA dos genes relacionados a homeostase térmica e metabólica (HSP70 e LDH) do tecido muscular em algumas espécies de caranguejos braquiúros (Armases rubripes, Aratus pisonii, Cardisoma guanhumi, Goniopsis cruentata, Ocypode quadrata, Pachygrapsus transversus, Neohelice granulata, Uca uruguayensis e Ucides cordatus). 
    A análise da expressão quantitativa (qPCR) desses genes, bem como a análise da atividade Na+/K+- e V-ATPase, nas várias espécies de caranguejos chama-marés em função da salinidade diferente, foi iniciada mais ainda não finalizada, portanto não serão apresentados nesse relatório. Essas informações, apoiadas sobre uma boa proposta filogenética para o grupo de espécies de caranguejos estudadas, e amparadas por métodos comparados relevantes que utilizam uma estatística coerente, provavelmente revelarão a versatilidade existente em nível de regulação gênica, e o papel fundamental das proteínas codificadas nos processos de ajuste a desafios fisiológicos osmorregulatório ou térmico.
     
    Desse modo, a investigação segue a contento. No entanto, o presente relatório demonstra também a necessidade de se incluir um aditivo temporal, na forma da prorrogação da vigência da bolsa de pós-doutoramento, para que as análises bioquímicas e moleculares possam ser finalizadas de forma padronizada e criteriosa, o que não será possível no prazo proposto anteriormente. O atraso se deve a elevada quantidade de informações propostas e geradas e, ainda, a algumas intempéries ocorridas durante o período de estudo.
     

    Produção(ões) bibliográfica(s) gerada(s) pelo projeto:

    Total de produções bibliográficas: 0


  • Data de cadastro do projeto: 23/04/2012  
  • Data da última modificação: 30/08/2012  
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