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Projeto de pesquisa


  • Uso de “Autonomous reef monitoring structures” no inventário e monitoramento da fauna marinha críptica

     
  • Coordenador do projeto: Tito Monteiro da Cruz Lotufo  
  • Autor ou executor principal do projeto: Tito Monteiro da Cruz Lotufo  
  • Número do projeto: 961  
  • Categoria: Projeto autônomo 
  • Data de início das atividades no CEBIMar: 17/07/2017  
  • Data de término das atividades no CEBIMar: 31/12/2021  
  • Resumo:
    A diversidade dos organismos com hábitos crípticos em ambientes coralíneos representa um dos grandes desafios para o conhecimento da biodiversidade marinha. Com o intuito de estudar a biota críptica de áreas recifais, foi desenvolvida uma estrutura artificial cúbica e desmontável denominada de Autonomous Reef Monitoring Structure (ARMS). Estas estruturas são mantidas submersas por cerca de um ano, permitindo o recrutamento da biota críptica, que pode então ser coletada de forma eficiente e sem dano ao ambiente. Os ARMS já estão sendo usados na última década em dezenas de localidades do mundo, abrangendo uma grande variedade de sistemas coralíneos. Neste projeto se pretende utilizar ARMS para o inventário da biota críptica de áreas insulares costeiras em São Paulo, com a instalação num total de 4 pontos, nas seguintes unidades de conservação: Estação Ecológica Tupinambás, Parque Estadual da Ilha Anchieta e Refúgio da Vida Silvestre de Alcatrazes. Os ARMS serão instalados em triplicatas em cada ponto, em profundidades ao redor de 10m, permanecendo submersos por um período aproximado de 12 meses. Após o período de submersão, os ARMS serão substituídos e processados, com os organismos coletados, fotografados e preservados para identificação morfológica e geração de sequências de DNA barcoding. Uma segunda etapa do projeto envolverá o uso de meta-barcoding, utilizando plataformas de sequenciamento massivo para obtenção de sequências curtas para comparação com bases de dados. Se espera, dessa forma, descrever a diversidade da biota críptica do infralitoral rochoso das ilhas costeiras estudadas.
     
  • Metodologia: Os ARMS são pequenas estruturas de coleta que imitam a complexidade estrutural de ambientes recifais, confeccionados para atrair invertebrados bênticos servindo como substrato e habitat. É composto por uma série de 8 a 10 placas de PVC cinza medindo 225mm x 225mm x 6,3mm, padronizadas, arranjadas em camadas abertas e obstruídas alternadas, fixadas em uma base de 35 cm x 45 cm. 
    As estruturas serão colocadas em número de 3 por ponto de amostragem, distando cerca de 2-4m umas das outras.
    Foram selecionadas duas áreas para este projeto, localizadas em unidades de conservação de proteção integral: ESEC Tupinambás, REVIS Alcatrazes e PE Ilha Anchieta. Em Alcatrazes as estruturas serão colocadas em duas áreas distintas, no Saco do Funil e no Paredão.
    Na Ilha Anchieta, será instalado um conjunto na sua face leste, e na Ilha das Palmas a instalação será feita na face norte. Todos os ARMS serão instalados em profundidades em torno de 10m, de forma a tornar os dados comparáveis.Os ARMS permanecerão instalados por cerca de 12 meses, e serão monitorados de forma contínua com visitas bimensais para registro fotográfico e avaliação da integridade e nível de incrustação externa. No termino do período de submersão, os mesmos serão recuperados, desmontados, todas as faces fotografadas, e os organismos identificados. Deverão ser geradas ainda sequências para DNA barcoding das espécies presentes nos ARMS. 
     
  • Etapas e cronograma: Atividades:
    Preparação dos ARMS – Ano1 – meses 1, 2
    Instalação e monitoramento dos ARMS – Ano 1 meses 3 e 4, 6, 8, 10, 12; Ano 2 meses 2, 6, 8, 10, 12.
    Substituição e processamento dos ARMS recolhidos – Ano 2, meses 3 e 4
    Identificação dos organismos coletados e geração de DNA barcodes – Ano 2 meses 3 a 12
    Preparação das amostras e geração de sequências para meta-barcoding – Ano 2 meses 3 a 6
    Treinamento em bioinformática para análise das sequências – Ano 2 mês 7
     
     
  • Palavras-chave: Diversidade críptica, ARMS, meta-barcoding 
  • Condições ambientais: Baixo hidrodinamismo ;   
  • Área necessária no laboratório: 20-30 metros quadrados 
  • Equipamentos de laboratório: Lupa, microscópio.  
  • Será necessário: Colocação ou fundeio de alguma estrutura no mar ;  Auxílio técnico para manutenção de estruturas ou material biológico na ausência dos participantes do projeto ;  Auxílio técnico para coleta de organismos ou observações de campo ;  Utilização de embarcação do CEBIMar ;   

  • Outros serviços de laboratório: Eventualmente gostaríamos de utilizar a infra-estrutura do laboratório de biologia molecular e microscopia avançada para registros fotográficos. 
  • Organismos a serem coletados: Não serão coletados grupos específicos. 
  • Locais para coleta: Ilha de Alcatrazes 
  • Tipos de resíduos químicos e/ou infectantes a serem gerados durante o projeto: Formaldeído DMSO Álcool etílico  
  • Quantidade de cada tipo de resíduo: Formaldeído - cerca de 5L de formaldeído em solução a 4% DMSO - cerca de 50mL de solução saturada Álcool etílico - cerca de 5L
  • Periodicidade aproximada da geração dos resíduo: Anual
  • Instituição(ções) de origem do projeto:

    • USP. Instituto Oceanográfico   
     
  • Participante(s) do projeto:

    • Nome: Carolina Cristina Medeiros  
    • Função no projeto: Mestrando 
    • Início das atividades no projeto: 15/09/2017  
    • Fim das atividades no projeto: 13/12/2021  
    • Nome: Morgan Jean Gaëtan Danielo  
    • Função no projeto: Doutorando 
    • Início das atividades no projeto: 15/09/2017  
    • Fim das atividades no projeto: 01/12/2021  
     
  • Recurso(s) destinado(s) ao projeto:

    • Situação: Solicitado 
    • Agência de fomento: Fapesp 
    • Tipo de recurso: Auxílio á pesquisa 
    • Especificar o tipo de recurso: Projeto regular de auxílio à pesquisa. 
    • Recursos em nome de: Tito Monteiro da Cruz Lotufo 
     

    Etapas desenvolvidas e resultados obtidos:

  • Instalação dos ARMS
    Os ARMS foram instalados em 4 sítios específicos, sendo 2 em Alcatrazes, 1 na Ilha das Palmas e 1 na Ilha das Cabras (Figura 2).

    Figura 2. Locais de instalação dos ARMS em Alcatrazes (esquerda) e Ilhas das Palmas e Cabras (direita), indicados pelos pontos vermelhos.
                Como programado, as instalações foram feitas em triplicatas, fixadas às rochas por meio de cabos de polietileno e braçadeiras plásticas a uma profundidade de cerca de 10m. As triplicatas distam entre 3-5m umas das outras. Cada unidade foi lastreada com dois cilindros de PVC preenchidos com chumbo, num total aproximado de 4kg por unidade.

    Figura 3. ARMS sendo instalados pela equipe e aspecto após a instalação completa.
                As unidades de Alcatrazes foram instaladas nas seguintes posições:
    Conjunto 1. Instalado em 26/03/2019 próximo à bóia do ICMBIO do ponto identificado como “geladeira”. Profundidade média 10m.
    Conunto 2. Instalado em 26/03/2019 próximo à bóia do ICMBIO do ponto identificado como “oratório”. Profundidade média 10m.
                As unidades das Ilhas das Palmas e Cabras foram instaladas nas seguintes coordenadas:
    Conjunto 3. Instalado em 16/04/2019 na Ilha das Palmas, nas coordenadas 23°32’43,0”S e 045°01’41,1”W a cerca de 10m de profundidade.
    Conjunto 4. Instalado em 16/04/2019 na Ilha das Palmas, nas coordenadas 23°31’01,1”S e 045°02’30,6”W a cerca de 10m de profundidade.
                A instalação foi documentada e divulgada pelo laboratório e pelo ICMBIO utilizando o Facebook (Figura 4). Um vídeo da instalação também foi divulgado no Facebook e está disponível no Youtube: https://youtu.be/SYmADlysgKo

    Figura 4. Divulgação pelo ICMBIO do projeto ARMS.
    Estudo da fauna críptica do Arquipélago de Alcatrazes
                De forma a subsidiar o estudo com os ARMS, se está realizando preliminarmente um inventário da biota críptica com a geração de sequências do gene da Citocromo Oxidase I, utilizado como padrão para o DNA barcoding. O trabalho foi iniciado com o estudo de interações entre rodófitas calcárias e ascídias didemnídeas, que se observou que compunha parcela importante da cobertura epilítica de Alcatrazes.
    As coletas foram realizadas na Ilha Alcatrazes, na região mais abrigada da ilha (noroeste), e foram coletadas 14 amostras, a 13 metros de profundidade. Mais 3 amostras foram coletadas na Ilha do Farol, a aproximadamente 21 metros de profundidade. Foram coletadas amostras da associação de interesse, assim como amostras de ascídias sobre substrato rochoso. 
    As associações foram removidas do substrato com o auxílio de um raspador e mantidas em sacos plásticos com água do mar e mentol (anestésico). Após a coleta, as amostras foram preservadas em parte com etanol 96% (para a seguinte extração e amplificação dos fragmentos de DNA) e em parte com formol salino a 4% (para a análise morfológica das ascídias). Em laboratório, após 4 dias fixadas em formol, as frações das associações que receberam esse tratamento foram transferidas para etanol 70%, sendo mantidas em temperatura ambiente. As amostras voltadas para análise genética foram armazenadas a 4 °C.
    As 17 amostras coletadas foram analisadas em laboratório quanto à morfologia, utilizando os procedimentos usuais de dissecção, preparação e coloração. Segue abaixo a relação do material examinado. As descrições e imagens feitas das espécies já conhecidas não foram incluídas dado o espaço reduzido do relatório, e constarão de publicação que será em breve submetida:
    Didemnum galacteum Lotufo & Dias, 2007
    Material examinado: SPAL0916-002, SPAL0916-003, SPAL0916-004, SPAL0916-008, SPAL0916-013, SPAL0916-014
    Didemnum speciosum(Herdman, 1886)
    Material examinado: SPAL0916-017
     
    Didemnum sp.1
    Material examinado: SPAL0916-010, SPAL0916-011
    Descrição:
    As colônias tem coloração branca, com a superfície da túnica repleta de papilas (Figura 5). Há alta densidade de espículas em toda a túnica, sendo observado um tipo ptincipal: estreladas com cerca de 8 raios cônicos por plano focal (medindo de 20 – 25 µm). Colônias alcançando cerca de 1 cm de diâmetro e com espessura de até 2 mm, com zoóides organizados em uma única camada na túnica. 
    Os zoóides têm cerca de 1 mm de comprimento, apresentando tórax e abdome de aproximadamente mesmo tamanho. A faringe possui 4 fileiras de fendas, sendo que o número de fendas decresce no sentido antero-posterior (5 fendas nas duas primeiras fileiras, 4 na terceira e 3 na quarta) (Figura 5D). Os órgãos torácicos laterais são triangulares e grandes, posicionados na altura da quarta fileira de fendas. O sifão oral tem 6 lobos triangulares e proeminentes, e a abertura atrial é muito ampla, deixando quase toda a faringe exposta. O testículo é único, sobre o qual o espermiduto é enrolado em 6-7 voltas (Figura 5E); um único óvulo grande e bem desenvolvido pode ser observado.

    Figura 5. Didemnum sp.1. A) Colônias in vivo, associadas a algas calcárias articuladas, na Ilha Alcatrazes; B) Aspecto globoso da colônia ao cobrir completamente um ramo calcificado da alga articulada; C) Detalhes do padrão criado pelas papilas da túnica; D) Tórax, com órgãos torácicos laterais triangulares visíveis; E) Abdome com testículo e espermiduto (à esquerda) em detalhe. Fonte: fotos tiradas em laboratório sob estereomicroscopia.
    Didemnum sp.2
    Material analisado: SPAL0916-006, SPAL0916-007, SPAL0916-016
    Descrição:
     Colônias pequenas, alcançando no máximo 1 centímetro de diâmetro e menos de 1 mm de espessura, esbranquiçadas e de aparência lisa (Figura 6B). Apresenta alta densidade de espículas por toda a túnica, sendo estas de dois tipos principais: 1. Espículas esféricas com raios cônicos com cerca de 10 raios por plano focal, medindo de 20 a 25 µm; 2. Espículas esféricas e muito pequenas (alcançando até 12,5 µm), sem raios definidos. 
    Zoóides pequenos, alcançando no máximo 0,6 mm de comprimento, com abdome e tórax de aproximadamente mesmo tamanho (Figura 6A). A faringe possui quatro fileiras de fendas, com o órgão lateral oval posicionado na altura da terceira fileira. O sifão oral é pequeno, com seis lobos triangulares, e a abertura atrial expões somente parte das fileiras médias. O estômago é globular e grande, e o trato digestório apresenta uma constrição próxima à alça intestinal. O testículo é único, sobre o qual o espermiduto espiralado dá de 5 a 6 voltas.
    Larva muito distinta, apresentando somente duas papilas adesivas largas e curtas e três pares de ampolas grandes e arredondadas , com oscelo e estatocisto presentes e cauda perfazendo ¾ de volta no tronco (Figura 6C). 

    Figura 6. Didemnum sp.2: A) Esquema do zoóide; B) Aspecto geral da colônia; C) Larva. Fotografias tiradas em laboratório sob estereomicroscopia.
    Didemnum sp.3
    Material observado: SPAL0916-005, SPAL0916-012.
    Descrição:
    Colônias incrustantes, delgadas (alcançando até 2 mm de espessura), e com até 3 centímetros de diâmetro (Figura 7A). Muito brancas, devido à alta densidade de espículas por toda a superfície da túnica, sendo essas esféricas com cerca de até 10 raios cônicos por plano focal com diâmetros variando entre 10 e 25 µm.
    Zoóide alcançando cerca de 0,6 mm de comprimento, com tórax e abdome de aproximadamente mesmo tamanho, exceto quando está sexualmente maduro e as gônadas estão desenvolvidas, neste caso o abdome é até 1,5 mm maior que o tórax (Figura 7B). Faringe com 4 fileiras de fendas, e tórax com órgão torácico lateral em forma de “z” entre a altura da terceira e quarta fileiras. Sifão oral alongado e com 6 lobos pontudos e proeminentes (Figura 7D). Testículo único, grande (até 180 µm), sobre o qual o espermiduto espiralado dá de 7-8 voltas ( C). Larvas não foram encontradas nas colônias.

    Figura 7. Didemnum sp.3: A) Colônia crescendo sobre alga calcária; B) Zoóide; C) Abdômen, com testículo e espermiduto em detalhe (à esq.); D) Tórax, com órgão lateral em forma de “z” em destaque. Escalas: 100 µm. Fotos tiradas sob esteromicroscopia. 
    Extração e amplificação dos fragmentos de DNA
    Ascídias
    As ascídias conservadas em etanol 96% tiveram o DNA extraído com o uso dos kits comerciais Qiagen DNEasy Blood & TissueQiagen QIAamp DNA Micro KitEasyPure Marine Animal Genomic DNA Kitda TransGen Biotech Co, seguindo os protocolos recomendados pelas empresas fabricantes, com digestão prévia dos tecidos com banho a 56ºC durante 3-4h com proteínase K; ou pelo uso de resina Chelex®100, da Bio-Rad Laboratories, diluída a 10%, seguindo protocolo adaptado de Walsh, S. P., Metzger A. e Higuchi, R. (1991). As extrações foram feitas de forma a minimizar as chances de contaminação por ovos, larvas e/ou epibiontes – as colônias eram dissecadas e cerca de 30 tórax dos zoóides eram retirados. 
    Após, os produtos de extração eram analisados por espectrofotometria no aparelho DeNovix DS-11 FX e armazenados a -20 ºC. Os produtos de extração que apresentassem bons resultados eram então amplificados por meio de PCR (reação em cadeia com polimerase). Para a reação de amplificação da região do gene Citocromo Oxidase I (COI) foi utilizado o premixAmpliTaq Gold® 360 Master Mixda Applied Biosystems, sendo preparadas soluções de 25 µL, seguindo os protocolo indicado pela fabricante. A solução incluía 1 µL de produto de extração de DNA, 1 µL de cada iniciador (forwardreverse), 12,5 µL do premix, 1 µL de 360 GC Enhancer e 9,5 µL de água MilliQ. Após tentativas de amplificar o gene COI utilizando os iniciadores universais descritos por Folmer et al. (1994)não gerarem bons produtos, iniciadores desenvolvidos para tunicados foram utilizados. 
     Para os iniciadores TUNF e TUNR, descritos por Stefaniak et al. (2009), após a etapa de desnaturação inicial a 94ºC por 10 minutos, foram efetuados 60 ciclos de PCR constuídos por desnaturação a 94ºC durante 10 segundos, anelamento a 55ºC durante 30 segundos e extensão a 72 ºC durante 50 segundos. Ao fim dos ciclos, uma etapa de extensão final a 72 ºC por 7 minutos foi efetuada.
    A qualidade e a quantificação dos produtos da PCR foram avaliadas por eletroforese em gel de agarose a 2,4% com tampão Tris-borato (TBE), com posterior foto-documentação. Os produtos com qualidade adequada foram purificados utilizando 
    Rodófitas calcárias
    As amostras de algas calcárias conservadas em etanol 96% foram analisadas sob estereomicroscópio para que fossem retirados epibiontes e microrganismos associados, de forma que cerca de 0,1 g de biomassa limpa de cada amostra foi separada para a extração de DNA genômico. Após, as amostras foram trituradas em almofariz e pistilo com resfriamento constante com nitrogênio líquido. 
    Três das amostras trituradas (SPAL0916-002, SPAL0916-003 e SPAL0916-004) foram transferidas para microtubos contendo 200 µL de solução contendo resina Chelex®100, da Bio-Rad Laboratories, a 10%e o DNA foi extraído seguindo o protocolo de Goff e Moon (1993). As demais amostras trituradas (SPAL0916-005, SPAL0916-008, SPAL0916-010, SPAL0916-011, SPAL0916-012, SPAL0916-013, SPAL0916-014, SPAL0916-016 e SPAL0916-017) foram transferidas para microtubos de 1,5 120 µLdo tampão PureLink™ Genomic Digestion Buffer do kit comercial PureLink™ Genomic DNA Mini Kit da Invitrogen e tiveram o DNA extraído de acordo com o protocolo recomendado pela fabricante. Os produtos de extração foram analisados por espectrofotometria no aparelho DeNovix DS-11 FX e então armazenados à -20 ºC.
    Para a amplificação da região 3’ do gene rbcL foi utilizado o premix AmpliTaq Gold® 360 Master Mixda Applied Biosystems, seguindo o protocolo descrito na seção anterior. Foram utilizados os iniciadores 577F e R-rbcS start, como descritos por Freshwater e Rueness (1994). As condições de ciclo seguiram o protocolo de Saunders e Moore (2013), com uma desnaturação inicial a 94 ºC durante 10 minutos, como recomendado pela empresa fabricante da enzima utilizada. 
    Sequenciamento e análises das sequências de DNA
    Somente os produtos de PCR para o gene COI das amostras de ascídias SPAL0916-006 e SPAL0916-007 foram enviadas para sequenciamento. Uma vez obtidas as sequências, as mesmas foram analisadas quanto à qualidade do sequenciamento nas duas direções, e foram editadas e alinhadas, formando uma sequência única, através do software Geneious (versão 11.1.5). As sequências editadas foram comparadas com as demais depositadas no GenBank e no BOLD.
    Ascídias
    As análises de qualidade e quantificação por eletroforese revelaram que grande parte dos produtos de PCR apresentavam bandas na faixa de ~710 pares de bases, tamanho esperado para a região do gene COI. Somente os produtos de PCR referente as amostras SPAL0916-002 e SPAL0916-003 não apresentaram bandas, enquanto a amostra SPAL0916-008 apresentou bandas inespecíficas (Figura 8). 

    Figura 8. Resultados da análise de qualidade e quantificação dos produtos de PCR. As siglas D02 à D17 foram utilizadas para os produtos de PCR referentes à SPAL0916-002 à SPAL0916-017, respectivamente. 
    Os produtos D06-1 e D07 (referentes as amostras SPAL0916-006 e SPAL0916-007, respectivamente) foram purificados e enviados para sequenciamento na empresa Macrogen. 
    Previamente ao uso dos iniciadores TUNF e TUNR, foram feitas tentativas de amplificar a região do gene COI utilizando os primers LCO1490 e HCO2198, descritos por Folmer et al. (1994), sem resultados. Apesar de serem considerados universais, quando estes iniciadores foram publicados não haviam muitas sequências completas do gene COI disponíveis, e análises recentes mostram frequentes incompatibilidades quanto ao sítio de anelamento e os iniciadores, que não são adequados a muitos grupos, não gerando bons resultados(Geller et al., 2013). Por conta disso, os iniciadores TUNF e TUNR foram deselvonvidos para tunicados (Stefaniak et al., 2009). No entanto, a incompatibilidade com iniciadores parece ser ainda mais frequente para a família Didemnidae (Stefaniak et al., 2009; da Silva Oliveira, Michonneau & da Cruz Lotufo, 2017)e é possível que os resultados obtidos sejam produtos secundários do uso de iniciadores inadequados combinados a um longo ciclo de PCR. 
    Rodófitas Calcárias
    De todas as amostras de algas calcárias, somente aquelas cujo DNA foi extraído utilizando a resina Chelex® 100 (SPAL0916-002, SPAL0916-003 e SPAL0916-004) não apresentaram bandas nas análises de qualidade e quantificação por eletroforese (Figura 9). As demais amostras tiveram fragmentos de DNA amplificados de tamanho próximo à faixa esperada para este marcador (Freshwater & Rueness, 1994; Saunders & Moore, 2013). As amostras devem ser enviadas para sequenciamento nos próximos meses. 

    Figura 9. Resultados da eletroforese horizontal de DNA em gel de agarose. As siglas R02 à R17 referem-se, respectivamente, aos produtos de PCR gerados apartir das amostras SPAL0916-002 à SPAL0916-017. 
    Referências:
    Folmer O., Black M., Hoeh W., Lutz R., Vrijenhoek R. 1994. DNA primers for amplification of mitochondrial cytochrome c oxidase subunit I from diverse metazoan invertebrates. Molecular marine biology and biotechnology3:294–299. DOI: 10.1371/journal.pone.0013102.
    Freshwater DW., Rueness J. 1994. Phylogenetic relationships of some European Gelidium (Gelidiales, Rhodophyta) species, based on rbcLnucleotide sequence analysis. Phycologia33:187–194. DOI: 10.2216/i0031-8884-33-3-187.1.
    Geller J., Meyer C., Parker M., Hawk H. 2013. Redesign of PCR primers for mitochondrial cytochrome c oxidase subunit I for marine invertebrates and application in all-taxa biotic surveys. Molecular Ecology Resources13:851–861. DOI: 10.1111/1755-0998.12138.
    Goff LJ., Moon DA. 1993. Pcr Amplification of Nuclear and Plastid Genes From Algal Herbarium Specimens and Algal Spores. Journal of Phycology29:381–384. DOI: 10.1111/j.0022-3646.1993.00381.x.
    Lotufo TM da C., Dias GM. 2007. Didemnum galacteum, a new species of white didemnid (Chordata: Ascidiacea: Didemnidae) from Brazil. Proceedings of the Biological Society of Washington120:137–142.
    Saunders GW., Moore TE. 2013. Refinements for the amplification and sequencing of red algal DNA barcode and RedToL phylogenetic markers: a summary of current primers, profiles and strategies. ALGAE28:31–43. DOI: 10.4490/algae.2013.28.1.031.
    da Silva Oliveira FA., Michonneau F., da Cruz Lotufo TM. 2017. Molecular phylogeny of Didemnidae (Ascidiacea: Tunicata). Zoological Journal of the Linnean Society180:603–612. DOI: 10.1093/zoolinnean/zlw002.
    Stefaniak L., Lambert G., Gittenberger A., Zhang H., Lin S., Whitlatch RB. 2009. Genetic conspecificity of the worldwide populations of Didemnum vexillum Kott, 2002. Aquatic Invasions4:29–44. DOI: 10.3391/ai.2009.4.1.3.
    Walsh P., Metzger D., Higuchi R. 1991. Chelex 100 as a medium for simple extraction of DNA for PCR-based typing from forensic. BioTechniques10:506–513.
     

    Produção(ões) bibliográfica(s) gerada(s) pelo projeto:

    Total de produções bibliográficas: 0


  • Data de cadastro do projeto: 20/06/2017  
  • Data da última modificação: 19/10/2017  

          

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