Projetos de pesquisa em andamento

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Projeto de pesquisa


  • Caracterização molecular e celular de proteínas hnRNPA/B em neurônios.

     
  • Coordenador do projeto: Roy Edward Larson  
  • Autor ou executor principal do projeto: Diego Torrecillas Paula Lico  
  • Número do projeto: 937  
  • Categoria: Projeto autônomo 
  • Data de início das atividades no CEBIMar: 01/02/2016  
  • Data de término das atividades no CEBIMar: 31/03/2018  
  • Resumo: Resumo
    Identificamos e purificamos uma proteína ligante de RNA de 65 kDa (p65) como um membro da família de heterogêneo nuclear ribonucleoproteínas, subclasse A/B (hnRNPA/B) nos terminais pré-sinápticos dos neurônios fotorreceptores de lulas (Lico et al., 2010; 2015). A caracterização molecular desta proteína revelou que em lulas há pelo menos 11 transcritos que codificam hnRNPA/B-like proteínas com alto grão de homologia. Entre eles, clonamos e expressamos em bactéria a hnRNPA/B-like proteína 2, que possui propriedades que implicou-a como subunidade da p65. Demonstramos que p65 é um dímero estável em SDS, ureia e DTT composto de subunidades de qual pelo menos uma é hnRNPA/B-like proteína 2 (Lico et al.,2015). Complexos ribonucleoproteínas participam em processos de splicing, translocação e estabilidade de mRNA no citoplasmo, e regulação local-específico de tradução. Recentemente, mutações em proteínas hnRNPA/B foram implicadas em doenças neurodegenerativas, pela indução ou facilitação de formação de corpos de inclusão no citoplasmo. Estes fatos, em conjunto com a localização do p65 na região pré-sináptica de neurônios de lula e a facilidade de isolar os axônios e sinapses gigantes destas lulas, levarem-nos a investigar as propriedades moleculares e celulares do p65.Esperamos que nossos resultados podem contribuir para compreender as propriedades moleculares de p65 especificamente (e proteínas hnRNPA/B-like em geral) e seu papel junto com RNA na regulação da função pré-sináptica.
     
  • Metodologia: A métodologia já padronizada e estabelecida no laboratório está descrita em (Lico et al.,2010 e 2015), inclusive a purificação de proteínas por cromatografia, preparação de sinaptossomas e fraçoes subcelulares, ensaios de oligo (dT) pulldown, identificação de proteínas por espectrometria de massas, análises in silico das sequências, clonagem, expressão e purificação de proteina recombinante, preparação de complexos mRNPs, imuno-histoquimica e imunofluorescência, SDS-PAGE e western blots.
    Anticorpos primários: Três anticorpos policlonais foram gerados contra p65 e hnRNPA/B-like proteina 2: a) o anti-squidRNP2 foi gerado em coelhos contra o peptídeo LFIGGLSYDTNEDTIKK, determinado por espectrometria de massas; b) o anti-squidRNPAc foi gerado em coelhos contra a proteína recombinante; e c) o antisquidRNPAg foi gerado em galinhas contra a proteína recombinante. Também, serão utilizados outros anticorpos comercialmente disponíveis como: anti-hnRNP A1, antihnRNP A2/B1, anti-PABP (poly-A binding protein), and anti-Elav (neuronal RNAbinding protein).
    Anticorpos secundários: Serão utilizados anticorpos comercialmente disponíveis conjugados com cromóforos fluorescentes para imuno-histoquimica e imunofluorescência e conjugados com enzimas específicas para western blots.
    Captura de lulas. As lulas (Doryteuthis pleii, espécie do Atlântico Sul, seguindo a nomenclatura do NCBI) serão coletadas na praia do Jabaquara (Município de Ilha Bela) e praia de Barequeçaba (Município de São Sebastião), litoral norte do Estado de São Paulo, nos meses de verão com o apoio do CEBIMar-USP em São Sebastião. 
     
  • Etapas e cronograma: A coleta de lulas será realizada no verão (dezembro a março) de 2016 a 2018. A exceção será no ano de 2016 com inicio das atividades em fevereiro a março. O periodo de 2016 a 2018 compreende ao desenvolvimento do processo FAPESP coordenado pelo Prof.Roy E. Larson.
     
     
  • Palavras-chave: Doryteuthis plei; sinaptossomas; axônio gigante e proteinas ligantes de RNA 
  • Condições ambientais: Água clara ;   
  • Área necessária no laboratório: lab com bancadas e torneiras com água doce e salgada; bicos de tomadas elétricas 110 e 220 v;  
  • Equipamentos de laboratório: Freezer; Geladeira; Lupa;  
  • Será necessário: Montagem de alguma estrutura (estantes, aquários etc) ;  Coleta antecipada de organismos ;   

  • Outros serviços de laboratório: Preparo de tanque com água salgada para mantermos as lulas vivas nas coletas. 
  • Organismos a serem coletados: Doryteuthis plei 
  • Locais para coleta: Praia do Jabaquara e Praia de Barequeçaba 
  • Tipos de resíduos químicos e/ou infectantes a serem gerados durante o projeto: nada consta 
  • Quantidade de cada tipo de resíduo: nada consta
  • Periodicidade aproximada da geração dos resíduo: nada consta
  • Instituição(ções) de origem do projeto:

    • USP. Outro órgão  Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto-FMRP/USP 
     
  • Participante(s) do projeto:

    • Nome: Roy Edward Larson  
    • Função no projeto: Escolha a função 
    • Início das atividades no projeto: 01/04/2016  
    • Fim das atividades no projeto: 01/05/2018  
    • Observações: Outros participantes:
      Gabriel Sarti Lopes (Doutorando), Depto. Biologia Celular e Molecular e Bioagentes Patogênicos da Faculdade de Medicina de Ribeirao Preto, Universidade de São Paulo.
      Dr. Joshua Rosenthal (pesquisador), Institute of Neurobiology, University of Puerto Rico 
       
     
  • Recurso(s) destinado(s) ao projeto:

    • Situação: Concedido 
    • Agência de fomento: Fapesp 
    • Tipo de recurso: Auxílio á pesquisa 
    • Especificar o tipo de recurso: Processo Fapesp 13151-2 
    • Recursos em nome de: Roy Edward Larson 
     

    Produção(ões) bibliográfica(s) gerada(s) pelo projeto:

    Total de produções bibliográficas: 0


  • Data de cadastro do projeto: 04/01/2016  
  • Data da última modificação: 11/05/2017  
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